細胞培養/コンフルエントに逹することなく培養細胞をタイミングよく継代したい

いきものと顕微鏡

細胞培養/コンフルエントに逹することなく培養細胞をタイミングよく継代したい
MDCK mx1-GFP cells, courtesy of Prof. Dr. Ralf Jacob, University of Marburg, Germany

コンフルエンシーの確認は意外と難しいー見る人によって基準が違う?

細胞培養を用いた実験でよく使われるコンフルエントという言葉は、「細胞をディッシュやフラスコで培養した時に、細胞が培養容器のどのくらいの割合を覆っているのか」を表すために使われます。英語の文章では、Confluenacy、Confluence、Confluent など、文脈によって単語の形が変化していることに気がつきますが、どれも増殖している細胞がどのくらい増えているか、つまり細胞密度を表していることに変わりはありません。

コンフルエンシーと継代のタイミング

コンフルエンシーは、通常、顕微鏡を使って観察した培養容器の状態から判断します。細胞が増殖し、培養容器の約半分が覆われると 50% コンフルエント、容器いっぱいに増えて互いに密着しだすと100%コンフルエントになります。

細胞が密着し互いに干渉している、細胞の成長に必要な栄養素が不足している、または代謝物質が蓄積しているなどの状態が続くと細胞の増殖が悪くなったり、死んだりしてしまうことがあります。そのため、適切なタイミングでの継代が必要になります。継代のタイミングは細胞株によって異なりますが、一般的には、コンフルエントの少し手前、80%程度のコンフルエンシーに達したタイミングで継代するのが望ましいと言われています。また、細胞は、コンフルエンシーのレベルに応じた、成長率の違いや遺伝子発現の特徴を示すことが多いため、最適な実験結果を得るためには、使用する細胞のコンフルエンシーを一定に保つことが必要です。

どうして毎日培養細胞をチェックしなくてはいけないのか?

継代に最適なタイミングを見極めるためには、日々の細胞の健康状態のチェックが必要不可欠です。目視観察による培養液の混濁や、急激なpHの変化や粒子の有無など、目視観察からからコンタミネーション(コンタミ)を判断することができます。

目視での確認が済んだら、倒立顕微鏡を使用して細胞の形態や増殖パターンをより詳細に観察します。倒立顕微鏡を用いることで、ディッシュの底に接着している細胞を簡単に視野に捉えることができますが、通常の明視野観察では、細胞を上手く見ることができないことが多いので、その場合は位相差観察法を用います。ディッシュ底面全体の観察には10-20倍の対物レンズが適切です。

いまが最適なタイミング… なのか?

培養細胞が理想のコンフルエンシーに達したまさにその瞬間を見極め、適切なタイミングで実験を開始するには、週末でもチェックを欠かさず、何度も繰り返し細胞の状態を確認しなければなりません。多大な労力を必要とする作業です。それに、細胞のチェックという単調なルーティンワークに多くの時間を費やさなければならないのはとても非効率だと言えるでしょう。

しかしながら、顕微鏡観察による主観的評価と手動の細胞カウントでは、客観性のある指標に基づいて正確にコンフルエンシーを把握することができません。当然ながら、観る人の感覚によって基準が変わるため再現性が得られにくく、ワークフローの標準化も難しくなります。本当に今が最適なタイミングなのか…?実験の結果にも影響する大切な意思決定を正確なデータに基づいて行いたいと考える人は多く、近年では多機能な自動セルカウンターの利用が広く普及しています。

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